なぜレンチウイルスの力価が低くなりやすいのか

レンチウイルスのパッケージングにおいて力価が低いのはよくある問題で、プラスミド設計、細胞状態、トランスフェクション条件、収集および保存の各段階が影響します。

1. プラスミド・ベクター関連

• ベクター構築の問題：LTR、Ψ パッケージングシグナル、WPRE、cPPT などの必須エレメントが完全に含まれているか。不足や変異があると力価が大きく低下します。

• プラスミドの純度：エンドトキシンや短い DNA 断片の混入は細胞の健康を損ない、産生効率を下げます。エンドトキシン除去型の精製を推奨。

• プラスミドの比率：トランスファーベクター : パッケージングベクター : エンベロープベクターの比が不適切だと産生量が下がります。

2. 細胞の状態

• 細胞株の選択：293T が一般的ですが、研究室ごとの株で産生能に差があります。

• 細胞密度：トランスフェクション時に希薄すぎても過密すぎても力価低下。最適は 70–80% コンフルエンス。

• 細胞の健康：汚染、継代回数の多さ、コンディション不良はすぐに産生効率に影響。

3. トランスフェクション条件

• トランスフェクション試薬と方法：PEI や Lipofectamine などの効果は条件によって大きく変わる。N/P 比や DNA:試薬比の最適化が必要。

• DNA 総量：多すぎれば細胞死、少なすぎればウイルス産生不足。

4. 培養条件

• 培地：血清の有無や、ウイルス産生専用培地の使用有無。

• 回収タイミング：通常 48 時間と 72 時間で回収。早すぎても遅すぎても力価低下。

• 回収方法：回収後のフィルター処理や凍結融解の繰り返しで力価が落ちる。

5. 濃縮と保存

• 超遠心や限外濾過：濃縮しないと力価が低いまま、特にレンチウイルスは AAV ほど産生量が高くない。

• 保存条件：−20℃保存や凍結融解の繰り返しは急速に力価を落とす。−80℃保存が基本。

6. 力価測定方法

• qPCR vs 機能的力価：qPCR で得られるゲノム力価は、実際の感染力価より高く出る傾向。

• 検定細胞株：標的細胞のレンチウイルス感受性によって結果が大きく変わる。

改善のヒント

• プラスミド構築を再確認し、高純度・エンドトキシンフリーを使用。

• 健康な 293T 細胞を使い、最適密度でトランスフェクション。

• トランスフェクション条件を最適化（DNA:試薬比など）。

• 48 h・72 h の上清を両方回収し、組み合わせて使用。

• 超遠心または限外濾過で濃縮。

• 力価検定方法を統一し、「見かけ上の低値」を回避。