AAVパッケージングにおける一般的な問題と原因

一、よく見られる問題と原因

1. ウイルスタイターが低い

• 考えられる原因：

  • トランスフェクション効率が低い（HEK293T細胞の状態不良、密度不適切、試薬の問題）。

  • Rep/Cap または Helper プラスミドの品質低下（分解、濃度不正確）。

  • 転移ベクターの ITR 領域が変異または欠損 → 複製・パッケージングができない。

  • ベクターサイズが大きすぎる（AAV のパッケージング限界は約4.7 kb）。

  • 回収時間が不適切（通常 48–72 時間が最適）。

2. 細胞の状態が悪い（死滅／接着しない）

• 考えられる原因：

  • DNA やトランスフェクション試薬を過量添加 → 細胞毒性。

  • 補助プラスミドに由来するアデノウイルス遺伝子発現による細胞ストレス。

  • HEK293T が継代しすぎて高効率なトランスフェクション能を失っている。

3. 不純物が多く、精製が不十分

• 考えられる原因：

  • 細胞溶解が不完全 → ウイルス放出が不均一。

  • 溶解操作が過度（凍結融解の繰り返し）→ ウイルス粒子の破壊。

  • 精製工程の不備（PEG残留、ヨードキサノール勾配の不適切操作）。

  • 細胞残渣やタンパク質が残留 → 感染時に毒性を示す。

4. 感染効率が低い（タイターは高いのに）

• 考えられる原因：

  • Cap 血清型がターゲット細胞や組織に適合していない。

  • 宿主細胞に AAV 受容体や補助因子が欠如。

  • ウイルスが凍結融解で部分的に失活。

  • 精製不十分 → 感染単位が希釈される。

5. 外来遺伝子の発現が弱い／発現しない

• 考えられる原因：

  • プロモーターが不適切（例：CMVは神経細胞でサイレンシングされやすい）。

  • GOI の方向やフレームが誤っている。

  • ITR が破損・不完全 → 転写が正しく行われない。

  • ウイルス量が過剰 → 宿主防御反応で発現抑制。

二、トラブルシューティングと最適化のヒント

1. 細胞準備

   • 健康な HEK293T を使用（低継代、良好な状態、密度60–80%）。

   • トランスフェクション前に新鮮な培地に交換。

2. プラスミド品質

   • 濃度・純度を確認。

   • ITR 領域は特に注意（再構成で失われやすい）。制限酵素消化で確認。

3. トランスフェクション最適化

   • DNA/試薬の添加量を制御。

   • プラスミド比率を調整。

4. 回収と精製

   • 通常 60–72 時間で回収。

   • 精製法を選択（PEG濃縮、CsClまたはヨードキサノール勾配、カラムクロマトグラフィー）。

5. 応用関連

   • 実験目的に合わせて適切な血清型を選択。

   • 遺伝子サイズが大きい場合は split AAV を検討。

   • in vivo 実験では必ずエンドトキシンをチェック。

AAV パッケージングでの問題は主に トランスフェクション効率、プラスミドの完全性、ベクターサイズ、精製工程、血清型の選択 に起因することが多い。
これらを一つ一つ確認すれば、低タイターや感染効率低下の原因を突き止められる。