AAVプラスミド（アデノ随伴ウイルスプラスミド）の構成要素

重组AAVベクタープラスミドは、重组アデノ随伴ウイルス（rAAV）を生産するための設計図です。その構造要素は、大きく2つの部分に分けられます：1. 2つのITR間にありウイルスベクターとして機能する部分（最終的にウイルス粒子内にパッケージングされる部分）、2. プラスミドバックボーン部分（大腸菌内でのプラスミド増幅のためだけに必要であり、パッケージングされない部分）。

1. 逆方向末端反復配列（ITRs – Inverted Terminal Repeats）

• 位置と機能: プラスミドの両端に位置する、AAVゲノムの核心的なシス作用性配列です。

• 必要性: AAVゲノムの複製、生産プラスミドからの「切り出し」、そして最終的にウイルスカプシド内にパッケージングされるために必要な、野生型AAVに由来する唯一の配列です。ITRがなければrAAVを生産することはできません。

• 構造: ヘアピン構造を形成するパリンドローム配列で、長さは約145塩基対です。

2. プロモーター（Promoter）

• 機能: 下流の目的遺伝子の転写開始を制御し、遺伝子がどの細胞で、いつ、どのくらいの強さで発現するかを決定します。

• 種類:

  • 広域性強プロモーター: CMV（サイトメガロウイルス即時早期プロモーター）、CAG（CMVエンハンサーとチキンβ-アクチンプロモーターの複合プロモーター）など、ほとんどの細胞種で強力な発現を駆動します。

  • 組織・細胞特異的プロモーター: hSyn（ヒトシナプシンプロモーター、ニューロン用）、GFAP（グリア線維酸性タンパク質プロモーター、アストロサイト用）、Alb（アルブミンプロモーター、肝細胞用）など、遺伝子発現を特定の細胞に制限します。

3. 目的遺伝子（Gene of Interest, GOI）

• 機能: これはベクターの有効荷重（Payload）であり、送達して発現させたい遺伝子です（例：治療用遺伝子、GFPなどのレポーター遺伝子、shRNAなど）。

4. 終結シグナル / ポリA付加シグナル（Polyadenylation Signal, PolyA）

• 機能: 目的遺伝子の下流に位置し、mRNA転写の終結シグナルを提供し、その3’末端にポリAテールを付加します。これは、mRNAの核から細胞質への輸送とその安定性にとって極めて重要です。

• 一般的な種類: SV40 polyA、BGH（ウシ成長ホルモン）polyA、合成polyAなど。

5. 発現増強・制御のための補助要素（任意ですが一般的）

発現を最適化するため、しばしば発現カセットに以下の補助要素が追加されます。

• WPRE（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）: 終結子の前に配置され、mRNAの安定性と核外輸送を大幅に增強し、タンパク質発現レベルを向上させます。

• イントロン（Intron）: チキンβ-アクチン遺伝子由来のイントロンなど。イントロンの存在は、pre-mRNAのスプライシングと成熟効率を大幅に高め、遺伝子発現レベルを向上させることができます。

• miRNAターゲット配列（miRNA Target Sites）: 特定の細胞種で遺伝子発伝子を「沈黙」させたり「減らす」ために使用されます。例えば、ニューロン標的ベクターに肝細胞特異的miRNAのターゲット配列を追加すると、肝細胞に入ったウイルスの発現を沈黙させ、特異性を高めることができます（脱ターゲット効果の低減）。

6. プラスミドバックボーン（Bacterial Backbone）

この部分はrAAVウイルス粒子にパッケージングされません。その唯一の目的は、実験室で大腸菌を用いてこのプラスミドを大量増幅するためです。

• 細菌複製起点（ori）: pUC oriなど、プラスミドが細菌内で高レベルに複製することを可能にし、高収量のプラスミドDNAを得ます。

• 抗生物質耐性遺伝子: アンピシリン耐性遺伝子（AmpR）やカナマイシン耐性遺伝子（KanR）など、細菌培養過程中にこのプラスミドの转化に成功したコロニーを選択するために使用されます。