AAV（アデノ随伴ウイルス）包装後の精製方法

AAV（Adeno-Associated Virus）のウイルス包装後の精製工程は、最終的なウイルス力価、純度、および in vivo における安全性を左右する極めて重要なプロセスである。以下では、主要な精製方法、その原理、利点・欠点、適用シーンについて、研究および受託製造の観点から体系的に解説する。

1. AAV 主な精製方法一覧

2. 各精製方法の詳細

1️⃣ Iodixanol 密度勾配遠心 ⭐⭐⭐⭐⭐

原理
完全粒子（full capsid）と空粒子（empty capsid）の密度差を利用し、15%–25%–40%–60% の密度勾配中で分離する。

基本工程

• 細胞破砕（凍結融解反復または Benzonase 処理）

• Iodixanol 密度勾配への試料添加

• 超遠心分離（約 350,000 g、2–3 時間）

• 40% 層からウイルス回収

• 超ろ過による Iodixanol 除去およびバッファー交換

利点
✔ full / empty capsid の分離が可能
✔ コストが低く、確立された手法
✔ 研究室スケールに適している

欠点
✖ 操作熟練度に依存
✖ スケールアップが困難
✖ 宿主由来タンパク質・DNA 除去に限界あり

適用分野
👉 基礎研究、小規模 in vivo / in vitro 実験

2️⃣ 塩化セシウム(CsCl) 密度勾配 ⭐⭐

特徴

• full / empty capsid の分離能が非常に高い

• 精製時間が長い（24–48 時間）

• CsCl によるウイルス活性低下のリスク

現状
⚠️ 現在はほとんど使用されておらず、特殊な機構解析研究に限定される

3️⃣ カラムクロマトグラフィー精製 ⭐⭐⭐⭐

主な種類

• AVB Sepharose（親和クロマトグラフィー）

• イオン交換クロマトグラフィー（IEX）

• ゲルろ過クロマトグラフィー（SEC、ポリッシング工程）

代表的な工程例
細胞破砕 → ろ過 → 親和カラム捕捉 → 溶出 → IEX 精製 → 超ろ過・緩衝液交換

利点
✔ 高純度かつ高いバッチ間再現性
✔ 大量生産および GMP 対応が可能
✔ 宿主タンパク質・DNA 除去効率が高い

欠点
✖ コストが高い
✖ 血清型により結合効率に差がある（例：AAV5）

適用分野
👉 前臨床研究、IND、GMP 製造

4️⃣ PEG 沈殿 + カラム精製 ⭐⭐⭐

原理
PEG を用いて大容量上清から AAV を濃縮し、その後カラムクロマトグラフィーで精製を行う。

利点
✔ 大容量処理に適している
✔ 回収率が高い
✔ コストパフォーマンスが良好

欠点
✖ 最終純度は後続工程に依存
✖ PEG 残留の管理が必要

5️⃣ 超ろ過（TFF / Amicon）— 補助工程

主な目的

• ウイルス濃縮

• バッファー交換（PBS、DPBS、Pluronic F68 など）

⚠️ 単独の精製手段としては使用しない

3. 用途別おすすめ精製戦略

4. 精製後に必須の品質評価（QC）

• ウイルス力価（qPCR / ddPCR）

• Empty capsid 比率（AUC / TEM / ELISA）

• 宿主由来 DNA 残留量

• 宿主由来タンパク質（HCP）

• エンドトキシン（LAL）

• 無菌試験 / マイコプラズマ試験

5. よくある問題点

⚠️ 精製後の力価低下
→ 回収層の選択ミス / 過度な超ろ過 / empty capsid 増加

⚠️ in vivo 毒性・炎症反応
→ 宿主タンパク質・DNA・エンドトキシン除去不足

⚠️ 血清型ごとの回収率差
→ 血清型特性に応じた精製条件の最適化が必要