AAV 三質粒共トランスフェクションシステム （Three-plasmid AAV Packaging System）

AAV 三質粒共トランスフェクションシステムは、現在最も標準的かつ汎用性の高い AAV ベクター製造法であり、基礎研究から動物実験まで幅広く利用されています。

1. 三質粒システムの構成

① トランスファープラスミド（Transfer Plasmid）

目的遺伝子を搭載し、発現を担うプラスミド

構成要素：

• ITR（Inverted Terminal Repeat）×2

• プロモーター（CMV、CAG、EF1α、hSyn など）

• 目的遺伝子（GOI）

• PolyA シグナル

⚠️ 注意：ITR 間の全長は 約 4.7 kb 以下に制限されます。

② Rep/Cap プラスミド（Packaging Plasmid）

AAV ゲノム複製およびカプシド形成を担う

• Rep 遺伝子：AAV ゲノム複製

• Cap 遺伝子：AAV 血清型を決定（AAV2、AAV8、AAV9 など）

👉 Cap を変更することで血清型の切り替えが可能

③ Helper プラスミド（Helper Plasmid）

アデノウイルス由来の補助因子を供給

主な遺伝子：

• E2A

• E4

• VA RNA

これらは AAV 増殖に必須ですが、ウイルス粒子にはパッケージされず、安全性が高いです。

2. 三質粒共トランスフェクションの基本工程

1. HEK293 / HEK293T 細胞培養

2. 三種プラスミドを混合
   （一般的な質量比：1 : 1 : 1）

3. PEI または市販トランスフェクション試薬で導入

4. 48–72 時間培養

5. 細胞回収（AAV は主に細胞内に存在）

6. 細胞破砕 → ウイルス放出

7. 精製（ヨードキサノール密度勾配またはカラム）

8. 力価測定（qPCR / ddPCR）

3. 本システムの特長

• アデノウイルス不要で高い安全性

• 血清型選択の自由度が高い

• 再現性が高く、スケールアップ可能

• GMP 製造プロセスに対応

4. よくある問題点

• 力価が低い：
  トランスフェクション効率低下、Rep/Cap 品質不良、ITR 変異

• 感染効率が低い：
  血清型・プロモーター選択不適切

• 発現が弱い／発現しない：
  パッケージ容量超過、モデル不適合