アデノ随伴ウイルス（AAV）パッケージング力価を向上させる方法

―― 高力価 AAV 製造のための体系的最適化戦略 ――

アデノ随伴ウイルス（Adeno-Associated Virus, AAV）は、安全性が高く、免疫原性が低く、長期間安定した遺伝子発現が可能であることから、基礎研究および遺伝子治療分野で広く利用されています。しかし実際の製造工程においては、パッケージング力価の低下やロット間ばらつきが大きな課題となることが少なくありません。

本稿では、ベクター設計、細胞培養、トランスフェクション、回収および精製工程といった主要なステップに着目し、AAV 力価向上のための最適化戦略を体系的に解説します。

1. ベクターおよび遺伝子設計の最適化

1）挿入配列サイズの厳密な管理

AAV の理論的パッケージング上限：約 4.7 kb（ITR 含む）

ベクター全長が 4.9 kb を超えると、パッケージング効率および力価は著しく低下

最適化のポイント：

• Mini-CMV、hSyn などの短縮型プロモーターを使用
• 不要なタグや冗長配列を削除
• truncated WPRE（例：WPRE3）の採用

2）パッケージング細胞に毒性を示す遺伝子の回避

強い細胞毒性やアポトーシス誘導能を持つ遺伝子は、AAV 産生量を大幅に低下させる可能性があります

対策：

• 弱いプロモーターや組織特異的プロモーターの使用
• Tet-On などの誘導型発現システム
• miRNA ターゲット配列による発現制御

2. パッケージング細胞および培養条件の最適化

3）細胞株と細胞状態の管理

一般的に使用される細胞株：

• HEK293T / HEK293AAV

トランスフェクション時の推奨条件：

• 細胞密度：70～80%
• 低継代数（20 代未満）
• マイコプラズマ陰性

4）培養条件の最適化

• トランスフェクション後 6～8 時間で培地交換

3. トランスフェクション条件の最適化

5）三プラスミド共トランスフェクション比

代表的な推奨質量比：

※ 血清型（AAV2、AAV8、AAV9 など）により最適条件は異なります。

4. ウイルス回収および細胞破砕工程

6）最適な回収タイミング

• トランスフェクション後 48～72 時間
• AAV は主に細胞内に存在するため、細胞破砕が必須

7）細胞破砕およびヌクレアーゼ処理

凍結融解（−80℃ ↔ 37℃）を 3 回実施

Benzonase 処理：

• 最終濃度：50～100 U/mL
• 37℃、30～60 分

5. 精製方法と力価への影響

8）精製法の選択

研究用途：

• ヨードキサノール密度勾配遠心（高回収率・高活性）

中規模～製造用途：

• AVB / AAVX アフィニティクロマトグラフィー

9）濃縮および保存

超濾過 MWCO：100 kDa

凍結融解の反復を回避

6. 力価低下の主な原因

7. 上級者向け最適化戦略

• DoE（実験計画法）による体系的最適化

• 血清型ごとの独立した条件確立

• vg/mL と Functional Titer の同時評価