AAVを用いた遺伝子過剰発現（Overexpression）の設計ポイント

AAV（アデノ随伴ウイルス）を用いた遺伝子過剰発現（Overexpression, OE）実験における設計上の重要ポイントを、研究現場でよくある失敗例も踏まえて体系的にまとめます。
（※in vivo／in vitro 両方を想定しています）

1️⃣ 目的遺伝子（GOI）設計のポイント

■ ORFサイズ制限を最優先で確認

• AAVの搭載上限：≈4.7 kb（ITR含む）

• 実質的なGOIサイズ目安：
  3.0–3.5 kb以下（プロモーター・polyA・タグ含む）

👉 長い遺伝子では以下を検討

• 短縮アイソフォームの使用

• タグ（FLAG / HA / GFP）の削除

• dual AAV戦略（split AAV）

■ コドン最適化（特にヒト遺伝子をマウスで発現させる場合）

• 発現量を安定させたい場合は宿主特異的codon optimization推奨

• ただし過剰発現による毒性が懸念される場合は
  非最適化版の方が良いこともある

2️⃣ プロモーター選択（発現量と特異性を決める核心）

■ 強発現プロモーター（汎用）

■ 組織特異的プロモーター（in vivo）

👉 過剰発現＝強プロモーターが最適とは限らない
（毒性・発生異常・死亡の原因になりやすい）

3️⃣ 発現制御エレメントの最適化

■ polyA シグナル

• SV40 polyA（短く汎用）

• bGH polyA（発現安定性が高いがサイズ増）

■ WPRE の使用

• 発現量を2–10倍向上

• サイズ：≈600 bp → 容量に注意

• 安全性配慮で mutant WPRE 推奨

4️⃣ タグ・レポーター設計

■ タグの選択

5️⃣ 血清型（セロタイプ）選択＝in vivo成功の鍵

6️⃣ 投与量（Dose）の設計

• in vivo OEは過剰投与による毒性が最大リスク

• マウス全身投与目安：
  1×10¹¹ – 1×10¹³ vg / mouse

• 局所投与（脳内など）：
  1×10⁸ – 1×10¹⁰ vg / site

👉 必ずdose titrationを行う

7️⃣ コントロール設計（論文で必須）

• AAV-empty

• AAV-GFP

• 同プロモーター使用の陰性対照

• 発現確認用別抗体／RNAレベル検証

8️⃣ よくある失敗例 ⚠️

• AAV容量オーバー → 力価低下・発現しない
• 強すぎるプロモーター → 細胞毒性・死亡
• in vitro最適化設計をそのままin vivo使用
• 血清型と投与経路のミスマッチ

まとめ（設計チェックリスト）

✅ ORF＋制御配列が4.7 kb以内
✅ プロモーターは「強さ×特異性」で選択
✅ WPRE / polyA / Kozak を最適化
✅ 血清型と投与法が目的組織に適合
✅ 過剰発現毒性を想定したdose設計