なぜAAVベクター作製が毎回安定しないのか？

AAVベクター作製が毎回安定しない理由は、AAVが「複数の工程と因子が同時に最適化されて初めて成功するウイルス」だからです。
1つでも条件がずれると、力価・フル率・感染効率が大きく変動します。以下に研究現場で特に多い不安定要因を体系的にまとめます。

① プラスミド要因（最も再現性を壊しやすい）

✔ ITR配列の不安定性

• ITRは大腸菌で欠失・変異しやすい

• 制限酵素で線形化確認をしていないケースが多い

✔ プラスミド純度のばらつき

• エンドトキシン残存

• A260/280 は良好でも A260/230 が低い

✔ 発現カセットの問題

• 遺伝子サイズが大きい（4.7 kb 超）

• 強すぎるプロモーター（CMV等）による細胞毒性

② 細胞状態の変動（HEK293系）

✔ 継代回数・培養密度

• 高継代 → AAV産生能力低下

• トランスフェクション時の70–80%コンフルが重要

✔ 培養環境の微差

• 血清ロット差

• 抗生物質の有無

• CO₂・温度のわずかなズレ

➡ 「同じ条件のつもり」でも、細胞は同じ状態ではないことが多い

③ トランスフェクション工程のばらつき

✔ 3プラスミド比率

• Rep/Cap：Helper：GOI の微妙な差が影響

• 特に Rep/Cap 過剰は細胞毒性

✔ トランスフェクション試薬

• PEI の分子量・pH・保存状態

• DNA:PEI 比率の再現性

④ 血清型・Capの影響

✔ 血清型ごとの産生難易度

• AAV2・AAV5：比較的安定

• AAV8・AAV9：ロット間差が出やすい

✔ Cap遺伝子の毒性

• 特定Capが細胞増殖を阻害

⑤ 精製工程によるロス

✔ 精製方法の違い

• PEG沈殿 vs Iodixanol vs カラム

• フル粒子／エンプティ比率が変動

✔ 操作タイミング

• 回収が早すぎる or 遅すぎる（48–72 hが一般的）

⑥ QC評価法の「見えない差」

✔ 力価は高いのに効かない

• qPCR：エンプティもカウント

• 感染能は反映しない

✔ ロット比較が難しい

• 同じ vg/mL でもin vivo 効果が全く違う

まとめ：AAVが不安定な本質的理由

AAVは「生物×工学×操作精度」の積み重ね系
→ 1点でも再現性が崩れると、結果が毎回変わる

再現性を上げるための実践ポイント（重要）

• ITR確認を毎ロット必須

• HEK293のマスターセル管理

• トランスフェクション条件の数値化・固定化

• 精製法・回収時間の標準化

• 感染能ベースのQC（in vitro transduction）を導入