遺伝子サイズがAAVパッケージングに与える影響とは？

AAV（Adeno-Associated Virus）において遺伝子サイズ（＝ITR間に挿入される全長）は、パッケージング効率・力価・機能性に最も強く影響する因子の一つです。

1️⃣ AAVが許容できるサイズの基本原則

🔹 AAVの物理的上限

• 最適サイズ：4.2–4.7 kb

• 理論上限：約4.9 kb

• ITR（145 bp ×2）を含めた全長が対象

👉 「目的遺伝子だけ」ではなく、プロモーター・polyA・WPRE等すべて込みで計算する必要があります。

2️⃣ 遺伝子サイズ別の影響

🟢 ① 小さすぎる（＜3.0 kb）

起こりやすい問題

• 空カプシド（empty capsid）の増加

• 不完全ゲノム（truncated genome）

• 力価は高いが発現が弱い

理由

• Repが効率よくフルゲノムを詰められない

• パッケージングの「中身不足」

🔧 対策

• WPREやstuffer配列を入れてサイズ調整

• 3.8–4.5 kbに近づける

🟡 ② 最適範囲（3.8–4.7 kb）

理想的な状態

• 高いパッケージング効率

• 力価と感染効率が一致しやすい

• フルレングスゲノム率が高い

👉 最も再現性が高く、安定したAAVが得られる

🔴 ③ 大きすぎる（＞4.7 kb）

典型的な問題

• 力価が急激に低下

• qPCRでは高力価だが感染効率が低い

• 発現ばらつき・再現性低下

理由

• カプシドに完全に収まらない

• ゲノム断片化・部分パッケージング

• 5’側欠損が頻発

📌 特に4.9 kb超では「力価は出るが使えない」AAVになりやすい

3️⃣ 「力価は高いのに効かない」原因との関係

遺伝子サイズが大きい場合、以下が同時に起こります：

4️⃣ サイズ超過時の代表的解決策

🔧 設計レベル

• プロモーターを短縮（CAG → miniCAG）

• polyAをSV40 → bGH

• WPRE削除 or truncated WPRE

• 不要なタグ削除

🔧 システムレベル

• Dual AAV（split AAV）

• Trans-splicing / Overlap AAV

• Intein分割法

5️⃣ 血清型との関係は？

• すべてのAAV血清型でサイズ制限は基本的に同じ

• AAV9やAAV-PHP系でも「入る量」が増えるわけではない

• 血清型変更でサイズ問題は解決しない

6️⃣ 実験設計でのチェックリスト（重要）

☑ ITR間サイズを正確に計算している
☑ 4.7 kbを超えていない
☑ 力価評価がqPCRだけで終わっていない
☑ 発現実験でフルレングス発現を確認している