AAVウイルス感染後、発現しない、または効率が低い

AAVウイルスを感染させたにもかかわらず発現しない／発現効率が低い場合、原因は「ベクター設計」「ウイルス品質」「感染条件」「宿主側要因」「評価方法」のいずれか（多くは複合）にあります。以下を上流→下流の順でチェックしてください。

1️⃣ ベクター設計の問題（最優先チェック）

• プロモーター不適合
  CMVは一部の初代細胞・in vivoで弱い／サイレンシングされやすい。
  → CAG、EF1α、hSyn、GFAP など細胞特異的に見直す。

• 遺伝子サイズ超過
  AAVの実効上限は ~4.7 kb（ITR含む）。超過すると空殻↑・発現↓。

• 配列依存性
  高GC、反復配列、毒性遺伝子、強いmiRNA結合部位 → 転写/翻訳低下。

• scAAVかssAAVか
  ssAAVは発現立ち上がりが遅い。早期評価では見逃しやすい。

2️⃣ 血清型（セロタイプ）不適合

• 細胞／組織との相性
  例）

  • 神経：AAV9、PHP.eB（※マウス系統依存）

  • 肝臓：AAV8

  • 網膜：AAV2

• 同じMOIでもセロタイプで10–100倍差が出ることは珍しくありません。
  → 可能なら2–3種類でスクリーニング。

3️⃣ ウイルス品質・滴度の問題

• 測定滴度＝機能滴度ではない
  qPCR高値でも、空殻多い／感染価低いケースあり。

• 保存・取扱い劣化
  凍結融解の繰り返し、4℃長期保存 → 活性低下。

• 不純物影響
  宿主DNA、エンドトキシン、残留PEG → 感染阻害。

✔ 対策：

• 新規ロットで再検証

• 凍結融解は最大1回

• 感染価（TCID50等）があれば参考に

4️⃣ 感染条件の最適化不足

• MOIが低すぎる／高すぎる
  高すぎると細胞毒性・IFN応答で逆効果。

• 感染時間が短い
  AAVは吸着が遅い。最低6–12時間、可能なら24時間。

• 血清・添加剤
  血清中因子が阻害する場合あり（条件比較を）。

5️⃣ 宿主側要因（見落としがち）

• 細胞分裂状態
  非分裂細胞では発現立ち上がりが遅い。

• in vivoでの中和抗体
  既存抗AAV抗体で感染阻害（特に霊長類・ヒト血清）。

• 免疫応答
  高MOIや特定配列で自然免疫活性化 → 発現低下。

6️⃣ 評価タイミング・方法の問題

• 観察が早すぎる
  ssAAVは7–14日でピークのことも。

• 検出感度不足
  蛍光弱い → qPCR / Western / RT-qPCR 併用を。

• レポーター選択
  EGFPが弱い場合、mCherry / tdTomatoで改善する例あり。

🔎 クイック診断フローチャート

1. 同じ条件で陽性対照AAVは発現する？
   　→ No：感染条件／細胞状態
   　→ Yes：ベクター設計／配列

2. 別セロタイプで改善する？

3. 観察日を＋7日延ばすと出る？

4. MOIを10倍レンジで振った？