AAV 介導による遺伝子ノックダウンおよび過剰発現の戦略

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、安全性が高く、免疫原性が低く、長期間安定した遺伝子発現が可能であることから、in vivo および in vitro の遺伝子機能解析に広く利用されています。AAV を用いた代表的な応用として、遺伝子ノックダウン（knockdown）と遺伝子過剰発現（overexpression）が挙げられます。本稿では、両戦略の原理、設計上のポイント、および適用場面について体系的に解説します。

1．AAV 介導による遺伝子ノックダウン

1）基本原理

AAV 介導の遺伝子ノックダウンは主に RNA 干渉（RNAi）機構に基づき、shRNA または人工 miRNA を発現させることで、標的遺伝子 mRNA の分解または翻訳抑制を引き起こし、タンパク質発現量を低下させます。

なお、AAV によるノックダウンは完全な遺伝子欠失ではなく部分的抑制であり、一般的な抑制効率は 50～80% 程度です。

2）主なノックダウン手法

（1）shRNA / miRNA ノックダウン

現在最も成熟し、広く利用されている手法です。

• AAV により shRNA または人工 miRNA を持続的に発現

• 細胞内で siRNA にプロセシングされ、ノックダウン効果を発揮

従来の shRNA と比較して、miR-30 などの miRNA scaffold を用いた設計は in vivo 実験において毒性が低く、発現の安定性にも優れているため、現在は推奨される設計です。

（2）CRISPRi（dCas9 + sgRNA）

DNA を切断せずに転写を抑制する手法で、可逆性と高い特異性を有します。ただし、構成要素が多く、AAV の搭載容量に制限があるため、二重 AAV システムが必要となる場合が多く、より高度な制御を必要とする研究に適しています。

3）プロモーターおよび制御方式

• U6 / H1 プロモーター：shRNA または sgRNA の発現に使用

• 組織・細胞特異的プロモーター：ノックダウン範囲の制限

• Cre-dependent（DIO / FLEX）システム：条件付きノックダウンの実現

2．AAV 介導による遺伝子過剰発現

1）基本設計

AAV による過剰発現は、目的遺伝子 cDNA を直接発現させることで、タンパク質レベルを人為的に上昇させる手法です。基本構成は
プロモーター – 目的遺伝子（GOI）– polyA
であり、必要に応じてタグやレポーター遺伝子を追加します。

2）プロモーター選択の指針

• CAG / CMV：強力な発現が必要な場合

• EF1α：比較的穏やかで安定した発現

• hSyn / CamKIIα：神経細胞特異的発現

• GFAP：アストロサイト特異的発現

• DIO / FLEX：条件付き過剰発現

3）AAV 過剰発現の制限事項

AAV の最大搭載容量は 約 4.7 kb（ITR 含む）です。これを超える、または上限に近い構築では、以下の問題が生じやすくなります。

• ウイルスタイターの低下

• 空カプシド率の上昇

• 発現の不安定化

また、キナーゼや転写因子などの調節タンパク質は、過剰発現により非生理的な表現型を引き起こす可能性があるため、慎重な検討が必要です。

3．ノックダウンと過剰発現の比較

一般的には、ノックダウンで表現型を確認し、その後過剰発現または rescue 実験で因果関係を検証する設計が推奨されます。

4．応用的な実験設計

• ノックダウン＋過剰発現 rescue

• Cre-lox 条件付きノックダウン／過剰発現

• Tet-on / Tet-off 誘導発現システム

• GFP、mCherry などのレポーター遺伝子との併用

5．実験上の注意点

• 高タイター＝高発現とは限らない

• in vitro で有効でも in vivo で再現されるとは限らない

• shRNA の毒性は過小評価されがち

• 大型遺伝子は AAV に不向き