AAV 超遠心分離バンドに含まれる主な不純物の解析

アデノ随伴ウイルス（AAV）の製造工程において、CsCl または Iodixanol 密度勾配を用いた超遠心分離は最も一般的な精製手法の一つである。本手法は粒子の密度差に基づいて分離を行い、遠心後には明瞭なバンドを確認することができる。

しかし、観察されるバンドがすべて有効な AAV 粒子であるとは限らない。目的バンドおよびその周辺には、複数の非理想的成分が混在していることが多く、これら不純物の理解は AAV 品質評価および実験結果の解釈において重要である。

1. バンド中に多く見られる不純物

1) 空カプシド AAV（Empty capsid）

空カプシド AAV は、超遠心分離後のバンドにおいて最も一般的な不純物である。
構造は完全な AAV と同一であるが、ウイルスゲノムを含まない。

• 目的遺伝子を発現しない

• 有効感染粒子比率の低下

• in vivo 実験における免疫反応リスクの増加

2) 部分包装 AAV（Partial genome particles）

部分包装 AAV とは、不完全または短縮されたゲノムを含む粒子を指す。

• 挿入遺伝子が AAV の包装容量上限に近い、または超える場合

• ITR 構造異常や再構成が生じた場合に発生しやすい

qPCR による vg 定量では正常に見える一方、実際の発現効率は低いことが多い。

3) 誤包装 DNA（Mis-packaged DNA）

AAV カプシドには、目的ゲノム以外の DNA が誤って包装されることがある。

• プラスミドバックボーン配列

• 宿主細胞由来ゲノム DNA

• helper plasmid 由来配列

これらは完全 AAV と密度が近く、バンド位置のみでの識別は困難であり、in vivo や非臨床研究において安全性上の懸念となる。

2. バンド外に存在する可能性のある不純物

4) 宿主細胞タンパク質（HCP）

超遠心分離後も一部の宿主細胞タンパク質が残留し、AAV 表面に吸着して存在する場合がある。

5) 遊離核酸（DNA / RNA）

細胞破砕やヌクレアーゼ処理が不十分な場合、遊離核酸が残留し、以下の影響を及ぼす。

• 勾配溶液の粘度上昇

• バンドの不明瞭化やテーリング

• 定量精度の低下

3. 超遠心分離法別のバンド分布特性

Iodixanol 勾配

• 15%–25%：タンパク質断片および軽度不純物

• 25%–40%：空カプシド AAV

• 40%–60% 境界：完全な AAV（目的バンド）

• 60% 以下：高密度不純物または凝集体

CsCl 勾配

• 空カプシド、部分包装、完全 AAV をより明確に分離可能

• ただし、工程時間が長く、ウイルス活性への影響が懸念される

4. AAV 品質評価に関する推奨事項

AAV の品質はバンド観察のみで判断すべきではなく、以下の指標を併せて評価することが推奨される。

• ウイルスゲノム量（vg）

• カプシド量または vg/capsid 比

• in vitro または in vivo における発現評価

まとめ

AAV 超遠心分離バンドに含まれる主な不純物は、空カプシドおよび異常包装粒子である。
バンドは粒子の密度分布を示すに過ぎず、ウイルスの機能的有効性を直接反映するものではない。
正確な AAV 品質評価には、定量解析と機能検証の併用が不可欠である。