組換えAAVの生成にはどのようなプラスミドが必要？

組換えAAV（rAAV）の生成では、最も一般的なのが3プラスミドシステム（three-plasmid system）です。使用するAAV生産プラットフォームによっては、2プラスミドシステム、4プラスミドシステムなど、異なる構成が採用される場合もあります。ただし、基本的な役割は共通しており、主に以下のプラスミドが使用されます。

1. トランスファープラスミド（Transfer Plasmid）

トランスファープラスミドは、目的遺伝子（Gene of Interest、GOI）を搭載するプラスミドであり、最終的にAAV粒子へパッケージングされる遺伝子配列を提供します。

典型的な構造は以下のとおりです。

ITR — プロモーター — 目的遺伝子（GOI）— PolyA — ITR

主な構成要素：

• ITR（Inverted Terminal Repeat、末端逆位反復配列）：AAVゲノムの複製やパッケージングに必要な配列で、組換えAAVゲノムの重要な境界となります。
• Promoter（プロモーター）：目的遺伝子の発現を制御します。代表的なものとして、CMV、CAG、EF1α、hSynなどがあります。
• GOI（Gene of Interest）：研究・導入の対象となる目的遺伝子です。
• PolyA（polyadenylation signal、ポリアデニル化シグナル）：転写終結やmRNAの安定化に関与します。

なお、最終的にAAV粒子へ主にパッケージングされるのは、2つのITRに挟まれた配列です。

2. Rep/Capプラスミド（Packaging/Capsid Plasmid）

Rep/Capプラスミドは、AAVの複製およびカプシド形成に必要なタンパク質を供給します。

主な構成要素は以下のとおりです。

• Rep遺伝子：Repタンパク質をコードし、AAVゲノムの複製やパッケージングなどに関与します。
• Cap遺伝子：AAVカプシドタンパク質VP1、VP2、VP3をコードします。

AAVの血清型によって異なる要素の一つがCap遺伝子です。

例えば、

• AAV2 Cap → AAV2カプシド
• AAV8 Cap → AAV8カプシド
• AAV9 Cap → AAV9カプシド

そのため、AAV9を生産する場合には、通常AAV9 Capを供給できるカプシドプラスミドを使用します。

3. Helperプラスミド（補助プラスミド）

Helperプラスミドは、AAVの生産過程に必要なヘルパーウイルス由来の機能を提供します。一般的にはアデノウイルス由来の遺伝子が利用されます。

代表的な補助機能には、以下が含まれます。

• E2A
• E4
• VA RNA

これらの因子は、細胞内でAAVの複製やカプシド形成に適した環境を構築するために必要です。

3プラスミドシステムを簡単に理解すると

つまり、全体の流れは次のように理解できます。

Transferプラスミドが「搭載する遺伝子」を提供 → Rep/Capプラスミドが「複製機能とカプシド」を提供 → Helperプラスミドが「生産に必要な補助機能」を提供 → 細胞内で組換えAAV粒子が形成される

4. なぜ「4プラスミドシステム」もあるの？

AAVの生産プラットフォームによっては、機能をさらに分割し、RepとCapを別々のプラスミドで供給する場合があります。

この場合、以下の4種類のプラスミドで構成されます。

1. Transfer plasmid
2. Rep plasmid
3. Cap plasmid
4. Helper plasmid

そのため、「3プラスミドシステム」と「4プラスミドシステム」は矛盾するものではありません。基本的な機能は同じであり、Rep/Capの機能をどのようにプラスミドへ分配するかという設計上の違いです。

まとめ

組換えAAVの生成では、Transfer、Rep/Cap、Helperという3つの主要な機能が重要です。特にTransferプラスミドには、AAVベクターとしてパッケージングしたい目的遺伝子が搭載され、ITRによってその領域が挟まれています。

AAVベクターの設計を理解する際には、ITR、Rep、Cap、Promoter、PolyAなどの各構成要素がどのような役割を持つのかを理解することが重要です。