AAVパッケージング後に発現しないのはなぜ？確認すべき6つのポイント

AAVのパッケージングが完了し、ウイルスも納品されたのに、細胞や動物実験で目的遺伝子の発現が確認できない。このような問題は、AAVを用いた研究で起こることがあります。

ただし、発現が確認できないからといって、直ちにAAVの製造不良と判断することはできません。ベクター設計、ウイルス品質、標的組織、投与条件、検出方法など、複数の要因を順番に確認する必要があります。

1. ゲノム力価と実際に使用したウイルス量

まず、AAVのゲノム力価と実際に使用した総ゲノム数を確認します。

総ゲノム数は、次の式で計算できます。

総ゲノム数（vg）＝ゲノム力価（vg/mL）×使用容量（mL）

ただし、vgはウイルスゲノムコピー数を示す指標であり、感染性や機能的な発現能力を直接示すものではありません。ゲノム力価だけで実験結果を判断しないことが重要です。

2. 血清型と標的細胞・組織が適合しているか

AAV血清型によって、細胞や組織への導入特性は異なります。

例えば、ある血清型が特定の動物モデルで有効だったとしても、別の動物種や系統、投与経路でも同様の結果が得られるとは限りません。

以下を確認しましょう。

• 使用した動物種および系統
• 標的組織や細胞
• 投与経路
• 関連する先行研究の実験条件
• 使用したAAV血清型の選択根拠

3. プロモーターが標的細胞に適しているか

AAVが細胞に導入されても、使用したプロモーターが標的細胞で十分に機能しなければ、目的遺伝子の発現が検出されない場合があります。

代表的なプロモーターには、以下があります。

• CAG：幅広い細胞での発現を目的とする場合に検討
• CMV：多くの細胞系で利用されるプロモーター
• EF1α：さまざまな細胞での発現に利用
• hSyn：神経細胞での発現を目的とする場合に検討
• GFAP：アストロサイト関連研究で検討
• TBG：肝細胞での発現を目的とする場合に検討

ただし、各プロモーターの発現特性は、動物種、組織、実験条件などによって変わります。

4. 発現カセットの設計に問題がないか

GOIの配列、向き、開始・終止コドン、プロモーターとの接続、PolyAなどの構成要素を確認します。

また、AAVの搭載容量を超えていないかも重要です。一般的な一本鎖AAVの搭載容量は約4.7 kbであり、発現カセット全体の長さを考慮する必要があります。

必要に応じて、プラスミド配列、ITRの状態、挿入配列の完全性などを確認しましょう。

5. AAVの品質指標を確認する

AAVの品質は、ゲノム力価だけでは評価できません。

確認したい主な項目は以下のとおりです。

• ゲノム力価
• カプシド力価
• ゲノム完全性
• 空カプシド・充填カプシドの割合
• 純度および凝集状態
• エンドトキシン
• 宿主細胞由来不純物

これらの項目は、それぞれ異なる品質特性を評価するものです。単一の数値だけでAAV全体の品質を判断することは避けましょう。

6. 投与・培養条件と発現検出方法を確認する

AAVの発現は、投与量、投与経路、観察時点、細胞状態、培養条件、検出方法などにも影響されます。

例えば、発現確認のタイミングが早すぎる場合や、検出方法の感度が十分でない場合には、発現を確認できないことがあります。

以下の項目を見直しましょう。

• AAVの保存・融解・取り扱い条件
• 投与量および投与経路
• 培養細胞の状態や実験モデル
• 発現確認までの時間
• 蛍光顕微鏡、Western blot、qPCRなどの検出方法
• 陽性・陰性対照の設定

PackGeneのAAVパッケージング・品質分析サービス

PackGeneは、AAVベクター設計、プラスミド構築、AAVパッケージング、精製および品質分析まで、研究プロジェクトに応じたサービスを提供しています。

AAVの発現に関する問題を検討する際には、ベクター構造、血清型、ゲノム力価、ゲノム完全性などの情報を総合的に確認することが重要です。

PackGeneでは、研究目的に応じたAAV製造および品質分析についてご相談いただけます。

AAVを使用しても目的遺伝子の発現が確認できない場合は、ベクター設計や品質データを含めて、原因を整理することが重要です。AAVパッケージングや品質分析について、PackGeneまでお問い合わせください。

よくある質問（FAQ）

Q1：AAVのゲノム力価が高いのに発現しないのはなぜですか？

ゲノム力価はウイルスゲノムコピー数を示す指標であり、実際の導入効率や発現量を直接保証するものではありません。血清型、プロモーター、ベクター構造、実験条件などを確認してください。

Q2：AAV投与後、どのくらいで発現を確認できますか？

発現確認までの時間は、血清型、標的組織、投与経路、実験モデル、発現カセットなどによって異なります。一律の観察時点を設定することはできません。

Q3：発現しない場合、最初に何を確認すべきですか？

まず、ベクター配列とプロモーター、血清型と標的組織の適合性、使用したウイルス量、品質報告書、検出方法を順番に確認することをおすすめします。