レンチウイルス感染で蛍光が見られない原因

Ⅰ．ウイルスパッケージングと力価の問題

• パッケージング効率が低い：トランスフェクション時のプラスミド比率が不適切、細胞状態が悪い、またはトランスフェクション効率が低いため、ウイルス粒子の産生が不十分になる。
• ウイルス力価が低い：感染時の MOI（多重感染数）が小さすぎて、大部分の細胞が感染されない。
• ウイルス粒子の質が悪い：パッケージングプラスミド（例：gag/pol、VSV-G）が欠損または失活し、ウイルスの完全性や感染力に影響する。

Ⅱ．目的遺伝子ベクターの問題

• 蛍光遺伝子自体の異常：ベクター上の蛍光タンパク質遺伝子に変異、フレームシフト、またはプロモーターの不活性化がある。

• ベクター構築エラー：挿入方向の誤り、欠失、または宿主細胞と適合しない制御エレメントがある。

• プロモーターのサイレンシング：一部の細胞では、CMV などの強力プロモーターがメチル化によってサイレンスされ、蛍光遺伝子が発現しない。

Ⅲ．感染および検出条件

• 宿主細胞の種類の問題：一部の細胞はレンチウイルス受容体の発現が不十分、または抗ウイルスメカニズムがあり、感染効率が低下する。

• 検出タイミングが早すぎる／遅すぎる：感染後、蛍光遺伝子の発現には時間が必要。早すぎる検出ではシグナルが見えず、遅すぎると細胞死や蛍光タンパク質の分解によりシグナルが失われる。

• 検出機器やパラメータの問題：顕微鏡やフローサイトメーターで励起／蛍光チャンネルの設定ミス、レーザー出力不足、パラメータ不適切。

Ⅳ．実験操作および外的要因

• 凍結融解の繰り返し：ウイルスを何度も凍結融解すると感染力が大幅に低下する。

• 培養条件の不備：感染時にポリブレン／プロタミン硫酸塩などの感染促進剤を使用していない、または細胞状態が悪い。

• 汚染や阻害因子：培地中に逆転写を阻害する物質が含まれている、または細胞自体が抗ウイルス因子を発現している。

段階的に確認することを推奨：

• まず p24 定量や qPCR によるウイルス遺伝子コピー数の測定でウイルス粒子産生を確認；

• 次に トランスフェクション効率と 力価を確認；

• ベクター構築や 蛍光遺伝子が陽性対照で正常に発現するかを確認；

• 最後に感染条件（細胞状態、MOI、感染促進剤）を最適化する。