レンチウイルスのパッケージング（包装）が失敗する原因は多岐にわたりますが、大きく分けて （1）細胞の状態, （2）質粒やトランスフェクション, （3）培養条件, （4）ウイルス構成要素 の4つに整理できます。
1. 細胞の状態に関する原因
| 原因 | 説明 |
| 細胞密度が不適切 | トランスフェクション時の細胞密度が高すぎる／低すぎると効率が低下。通常は50〜80%コンフルエンシーが最適。 |
| 細胞株の状態が悪い | 過剰継代、汚染（マイコプラズマなど）、ストレス状態だとウイルス産生能が低下。 |
| 細胞株の種類 | HEK293Tなど高効率にウイルスを産生できる細胞を使用していない場合。 |
| 抗生物質の影響 | 抗生物質がトランスフェクションやウイルス形成を阻害することがあるため、一時的に除去するのが望ましい。 |
2. 質粒およびトランスフェクション関連
| 原因 | 説明 |
| 質粒DNAの純度が低い | エンドトキシン混入、未精製DNA、A260/280比が不適切（1.8〜2.0未満）などで細胞毒性が出る。 |
| DNA比率の不均衡 | 4質粒系の場合、transfer vector・gag/pol・rev・VSV-Gのモル比が不適切だとウイルス形成がうまくいかない。一般に4:3:2:1などがよく使われる。 |
| トランスフェクション効率が低い | 試薬の劣化、DNA量過多／過少、培地のpHや血清成分の影響など。 |
| プロモーター不一致 | ベクターとパッケージング系のプロモーターが異なり、発現が十分でない。 |
3. 培養・回収条件
| 原因 | 説明 |
| 培地条件が悪い | 高血清濃度や低pHはウイルス産生を妨げる。Opti-MEMやFBS 5〜10%がよく使われる。 |
| 温度・CO₂条件のズレ | トランスフェクション後に温度変化（37°C±1°C）やCO₂濃度のズレがあると効率低下。 |
| 回収タイミング不適切 | 通常はトランスフェクション後48〜72時間が最も滴度が高い。回収が早すぎたり遅すぎたりすると失敗する。 |
| フィルターや遠心操作のロス | フィルター目詰まりや過度の遠心でウイルスを破壊してしまう。 |
4. ウイルス構成要素・ベクター設計
| 原因 | 説明 |
| 構成遺伝子の欠損・変異 | gag/polやrevなどの質粒に変異・欠損があるとウイルス形成不全。 |
| insertのサイズが大きすぎる | 8〜9 kb以上の挿入DNAではウイルスパッケージング効率が急激に低下。 |
| 毒性のある遺伝子を含む | 発現産物がHEK293Tなどの包装細胞に毒性を示す場合、ウイルスが生成されない。 |
| プロモーターの選択ミス | CMVプロモーターが沈黙する細胞株を使っているなど。 |
5. チェックポイント（トラブルシュート）
-
トランスフェクション後24hで蛍光マーカーが発現しているか確認
-
上清を回収する前に細胞の生存率を観察
-
ウイルス滴度をqPCRやp24 ELISAで定量して比較
-
パッケージング用DNAのモル比や量を最適化（例：3質粒系 vs 4質粒系）
PackGeneについて
PackGene Biotech is a world-leading CRO and CDMO, excelling in AAV vectors, mRNA, plasmid DNA, and lentiviral vector solutions. Our comprehensive offerings span from vector design and construction to AAV, lentivirus, and mRNA services. With a sharp focus on early-stage drug discovery, preclinical development, and cell and gene therapy trials, we deliver cost-effective, dependable, and scalable production solutions. Leveraging our groundbreaking π-alpha 293 AAV high-yield platform, we amplify AAV production by up to 10-fold, yielding up to 1e+17vg per batch to meet diverse commercial and clinical project needs. Moreover, our tailored mRNA and LNP products and services cater to every stage of drug and vaccine development, from research to GMP production, providing a seamless, end-to-end solution.
