AAVパッケージング過程で発生しやすい汚染

AAV（アデノ随伴ウイルス）パッケージングの過程では、細胞、プラスミド、作業環境などが原因となり、さまざまな汚染が発生しやすい。

1. 細胞由来の汚染

（1）微生物汚染（最も一般的）

• 細菌汚染：培地の白濁、pH低下、細胞死の加速。

• 真菌／酵母汚染：菌糸状または白色の浮遊物が観察される。

• マイコプラズマ汚染：肉眼での確認は困難だが、AAV産生量や感染価を低下させる。

（2）細胞株の交差汚染

• HEK293、HEK293T などの細胞株が混在した場合、パッケージング効率やウイルス品質が低下する。

2. プラスミド由来の汚染

（1）エンドトキシン汚染

• エンドトキシン濃度が高いプラスミドは細胞増殖を抑制し、AAV産生量を大きく下げる。

• “Endotoxin-free” レベルでの精製が必須。

（2）プラスミド純度不足／断片混入

• 宿主ゲノムDNAや大きな断片が混入すると、パッケージング効率が低下する。

（3）プラスミド間の交差汚染

• 誤ったプラスミドの混入、または混合比の誤りにより、ウイルスゲノムが不完全になる可能性がある。

3. ウイルス由来の汚染

（1）前バッチのウイルス残留

• 遠心管、フィルター、超遠心機アダプターを十分に洗浄しないと、前回のウイルスが持ち越される。

（2）野生型AAV（wtAAV）の混入

• ITR間の組換えにより発生し、安全性やゲノム構造に影響を与える。

（3）血清型の交差汚染

• 同一ラボで複数血清型を同時に扱う場合に発生しやすい。

4. 作業環境／操作由来の汚染

（1）無菌操作不徹底による微生物汚染

• ピペット、フィルター、インキュベーター、未滅菌の消耗品が原因となる。

（2）環境DNA汚染

• 高コピー数DNAを扱う作業環境下では、気溶化DNAがウイルスに取り込まれる可能性がある。

5. タンパク質・不純物由来の汚染

（1）細胞破片・外来タンパク質の混入

• 上清回収や細胞破砕工程で不純物が混入し、ウイルス純度を低下させる。

（2）未処理の細胞残渣

• 不適切な前処理により、タンパク質不純物が多量に残留する。

6. 汚染を防ぐためのポイント

• クリーンベンチでの無菌操作徹底

• マイコプラズマ陰性細胞株の使用

• エンドトキシンフリーのプラスミドを使用

• 血清型ごとに作業エリア分離

• 装置・消耗品の徹底洗浄／交換

• 定期的な細胞・環境モニタリング