AAVの感染効率が低い原因

Ⅰ．ウイルスそのものに関する要因

1. 力価（Titer）が低い

最も一般的な原因。実際の機能的力価が低い場合、MOI が十分に確保できず感染効率が低下する。
特に AAV2 などは機能力価が低くなりやすい。

2. 空カプシド（Empty Capsid）が多い

製造過程で空カプシド比率が高いと、有効なウイルス粒子数が減少し、感染効率が大きく低下する。

3. 血清型と標的細胞／組織のミスマッチ

AAV血清型は組織指向性が異なる。例：

• AAV9：心臓・筋肉・中枢神経

• AAV8：肝臓

• AAV-PHP.eB：マウスのCNS（他種では低効率）

適切でない血清型を選ぶと感染効率が大幅に低下する。

4. 遺伝子サイズが大きすぎる（上限超過）

AAVのパッケージング上限は 約4.7 kb。
サイズ超過は以下を引き起こす：

• 機能力価の低下

• 不完全なゲノム

• 感染効率の著しい低下

5. プラスミド構築上の問題

• ITR切断

• 配列の重複

• GC含量異常

• 標的細胞に適さないプロモーター（例：CMV が一部細胞で弱い）

Ⅱ．標的細胞／動物モデルに関する要因

1. 細胞表面受容体の発現不足

AAVは特定受容体に依存する：

• AAV2：HSPG

• AAV9：ガラクトース

受容体が少ない → 感染しにくい。

2. 分裂速度の速い細胞

AAVは 分裂細胞で効率が低下（エピソームとして存在し、細胞分裂で希釈される）。

3. 原代細胞・免疫細胞・幹細胞は感染しにくい

これらは AAV 感受性が低いことが多い。

4. 種差

例：PHP.eB はマウスでは高効率だが、ラット／霊長類／ヒトでは低効率。

Ⅲ．操作・実験手技に関する要因

1. 凍結融解の繰り返し

1回の凍結融解で 30〜50％ 感染能力が低下する。

2. 保存条件の不備

• −80°C で保存していない

• PBS など不適切なバッファー

• ピペッティングの繰り返しによるウイルス剪断

3. ウイルス添加方法が不適切

例：

• スピン感染（spin infection）を行っていない

• 細胞密度が不適切

• ウイルス量が少なすぎる／多すぎる（過量も阻害要因）

Ⅳ．動物実験特有の要因

1. 投与経路が不適切

例：

• CNS を狙うのに尾静脈投与 → 低効率

• 筋肉を狙うのに腹腔内投与 → ほぼ発現なし

2. 免疫反応によるウイルス除去

動物が自然抗AAV抗体を持つ場合、ウイルスが中和され感染効率が低下。

3. 血液による希釈・クリアランス

尾静脈投与後、AAV が血液で希釈・除去され、標的組織の発現が弱くなる。

Ⅴ．発現カセットに関する要因

1. プロモーターの選択ミス

• 弱いプロモーター（例：hSyn が非神経組織で弱い）

• 組織特異的プロモーターによる発現範囲の狭さ

2. 宿主による外来遺伝子の抑制

一部細胞では表現型抑制（エピジェネティックサイレンシング）が起こる。

◆ 迅速なトラブルシューティング（実用版）

1. 力価確認（最低 1E12–1E13 vg/mL）

2. 標的に合った血清型を再選択

3. 強力なプロモーター（CAG / EF1α など）に変更

4. 挿入遺伝子サイズの確認（4.7kb 以下）

5. 凍結融解は 1回まで

6. 事前に細胞のAAV感受性を確認

7. spin infection や MOI 増加を検討

8. 動物の投与経路が適切か再評価