高力価AAVを得るための3プラスミドシステムの重要ポイント

3プラスミドシステムは、現在最も広く用いられているAAV製造法であり、高力価・高再現性・高安全性を実現できる点が特長です。しかし、各工程の最適化が不十分だと、力価低下やロット差が生じやすくなります。

1. 3プラスミドの構成と品質管理

3プラスミドシステムは以下の3種類から構成されます。

• トランスファープラスミド
  ITR配列に挟まれた目的遺伝子（GOI）を搭載

• Rep/Capプラスミド
  AAVの複製・カプシド形成に必須

• ヘルパープラスミド
  アデノウイルス由来の補助因子（E2A、E4、VA RNAなど）を供給

重要ポイント

• プラスミドはEndotoxin-freeグレードを使用

• ITRの欠損・再配列がないことを事前に確認

• 長期保存や凍結融解の繰り返しは避ける

2. プラスミド比率の最適化

一般的な初期条件としては以下がよく用いられます。

• トランスファー：Rep/Cap：ヘルパー ＝ 1 : 1 : 1（重量比）

ただし、

• 血清型（AAV8、AAV9など）

• 遺伝子サイズ

• プロモーターの強度

によって最適比率は変化します。

ポイント
👉 力価が低い場合は、Rep/Cap量の微調整が有効なことが多い。

3. 細胞状態と培養条件

高力価AAV生産にはHEK293 / HEK293T細胞が一般的に使用されます。

• トランスフェクション時のコンフルエンシー：70〜80%

• 細胞の継代回数は低く保つ

• 培地の急激なpH変動を避ける

細胞の健康状態＝AAV力価
と言っても過言ではありません。

4. トランスフェクション条件

• PEIや市販トランスフェクション試薬を使用

• DNA：試薬比率を事前に最適化

• 混合後のインキュベーション時間を一定に保つ

注意点

• 過剰なDNA量は細胞毒性を引き起こし、逆に力価を下げる

• ロット間再現性を確保するため、操作条件を標準化する

5. 回収タイミングとウイルス放出

• 回収時期：トランスフェクション後48〜72時間

• 多くのAAVは細胞内に多く存在するため、細胞回収が重要

• 凍結融解または化学的溶解によるウイルス放出を実施

6. 精製方法の選択

高力価・高純度AAVを得るためには、用途に応じた精製法選択が不可欠です。

• ヨードキサノール密度勾配遠心

• カラム精製（AVB、AAVXなど）

研究用途・動物実験用途では
👉 フル粒子比率と宿主由来不純物の除去が重要

7. 力価測定と品質評価

• qPCR / ddPCRによるゲノム力価測定

• SDS-PAGE、Silver染色による純度評価

• 必要に応じて感染価（Functional titer）も確認