AAVを用いたin vivo遺伝子発現の基本戦略

AAV（アデノ随伴ウイルス）を用いた in vivo 遺伝子発現の基本戦略を、研究現場でそのまま設計に使えるレベルで体系的にまとめます。

1. 基本コンセプト：in vivo AAV遺伝子発現とは

AAV を用いた in vivo 遺伝子発現とは、生体内に直接 AAV ベクターを投与し、標的組織・細胞で目的遺伝子を発現させる手法です。

主な目的

• 遺伝子過剰発現（overexpression）

• レポーター発現（GFP、Luciferase など）

• shRNA / miRNA によるノックダウン

• CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子改変（KO / KI）

2. AAV in vivo 発現設計の全体フロー

基本設計は以下の5ステップで考えます

• 標的組織・細胞の決定
• AAV血清型（セロタイプ）の選択
• 発現カセット（プロモーター＋遺伝子）の設計
• 投与ルート・投与量の最適化
• 発現評価・解析

3. 血清型（セロタイプ）選択戦略

AAV の 組織指向性（tropism） は最重要要素です。

※ *AAV-PHP.eB はマウス系統依存性あり（C57BL/6 など）

4. 発現カセット設計の基本

4.1 プロモーター選択

発現特異性と発現量を決める核心要素

• 汎用強力プロモーター

  • CAG（最も汎用）

  • CMV（in vivo ではサイレンシング注意）

  • EF1α

• 組織特異的プロモーター

  • 肝臓：TBG, Alb

  • 神経：Synapsin, CamKIIα

  • 心筋：cTnT, α-MHC

  • 筋肉：MCK

4.2 遺伝子サイズ制限

• AAV のパッケージング上限：約4.7 kb（ITR含む）

• 大きい遺伝子では：

  • 短縮プロモーター

  • dual AAV 戦略

  • split-intein 法 を検討

5. 投与ルートと発現パターン

6. 投与量（Dose）の考え方

• 一般的なマウス in vivo 投与量
  1×10¹¹ ～ 1×10¹³ vg / mouse

• 初期検討では：

  • Low / Mid / High の3段階設計が推奨

• 過量投与のリスク：

  • 免疫応答

  • 肝毒性

7. 発現開始時期と持続性

• 発現開始：投与後1–2週間

• ピーク：3–4週間

• 持続：数か月〜1年以上（非分裂細胞）

• 特徴：

  • AAV は主に エピソーマル（非ゲノム挿入）

  • 分裂細胞では発現低下あり

8. 発現評価方法

• 分子レベル：qPCR（vg copy）、RT-qPCR

• タンパク質：WB、ELISA

• 組織：免疫染色、蛍光観察

• in vivo：IVIS（Luciferase）