AAVパッケージング効率が低いときのチェックポイント

AAV（アデノ随伴ウイルス）パッケージング効率が低い場合は、以下のポイントを系統的に確認すると原因特定と改善につながります。

① プラスミド設計・品質の確認

✔ ITR 配列の完全性

• ITR は非常に不安定で、欠失・変異があるとパッケージング効率が著しく低下

• 制限酵素消化やシーケンスで確認

✔ 遺伝子サイズ（全長）

• AAV の最適サイズ：4.1–4.7 kb

• 4.7 kb 超過 → 効率低下

• 3.5 kb 未満 → 不完全粒子が増加

✔ プラスミド純度

• Endotoxin-free、A260/280 ≈ 1.8–2.0

• 古いプラスミド・凍結融解の繰り返しはNG

② トランスフェクション条件

✔ 細胞状態（HEK293 / 293T）

• コンフルエンシー：70–80%

• Passage 数が多すぎない（≤20 推奨）

✔ プラスミド比率（3 プラスミド法）

一般的比率（質量比）：

• Transfer : Rep/Cap : Helper = 1 : 1 : 1
• 血清型により 1 : 1 : 2 が有効な場合も

✔ トランスフェクション試薬

• PEI：DNA:PEI = 1 : 3（w/w）

• 混合後 10–20 分静置

③ 血清型（セロタイプ）の影響

✔ 特定セロタイプは低効率

• AAV2, AAV8：比較的高効率

• AAV5, AAV9, 特殊改変型：低下しやすい

✔ Cap プラスミドの配列確認

• 突然変異・フレームシフトの有無

④ 培養・収穫条件

✔ 培養時間

• トランスフェクション後 48–72 時間 が最適

• 収穫が早すぎる／遅すぎると低下

✔ 培地条件

• 高グルコース DMEM 推奨

• トランスフェクション後 6–12 時間で培地交換

⑤ 精製工程によるロス

✔ 精製法の選択

• Iodixanol gradient：高効率・高再現性

• カラム精製：簡便だが回収率低下の可能性

✔ 不完全粒子の割合

• Empty capsid が多いと有効滴度が低く見える

⑥ 滴度測定の問題

✔ qPCR プライマー設計

• ITR 以外（WPRE, promoter）推奨

• DNase 処理必須

✔ 感染力 vs ゲノム滴度

• vg 高いが発現低い → 機能的粒子が少ない可能性

🔧 改善のための優先チェック順

1️⃣ ITR 完全性・サイズ
2️⃣ 細胞状態 & トランスフェクション効率
3️⃣ プラスミド比率
4️⃣ セロタイプ特性
5️⃣ 精製・滴度測定方法