AAVウイルスの包装における空カプシド比率が高い

AAV（アデノ随伴ウイルス）包装において空カプシド（Empty capsid）の比率が高いことは、研究・前臨床・臨床用途いずれでもよく見られる課題です。以下に原因 → 影響 → 改善策の順で整理します。

① 空カプシドが多くなる主な原因

1. ゲノムサイズ・配列設計の問題

ITR間サイズが小さすぎる／大きすぎる

• 最適：4.4–4.9 kb
• <3.8 kb や >5.2 kb では封入効率が低下

二次構造が強い配列（GCリッチ、リピート配列）

scAAVは構造上、ssAAVより空カプシドが増えやすい

2. 包装プラスミド比率・発現バランス

• Rep / Cap / GOI プラスミドのモル比不適切

• Cap発現が過剰 → カプシド形成は進むがゲノムが足りない

• Rep発現不足 → ゲノム複製が不十分

3. 細胞状態・培養条件

HEK293細胞の状態不良

• 過継代、コンフルエンシー過高

トランスフェクション効率が低い

培地条件（血清、pH、栄養）不適切

4. 収穫タイミング

• 早すぎる回収 → ゲノム封入が完了していない

• 一般的には トランスフェクション後 60–72時間が最適

5. 精製プロセスの影響

• ヨードキサノール勾配のみでは空カプシドが多く残存

• カラム条件最適化不足（AVB, AAVX など）

② 空カプシド比率が高いと何が問題か？

機能的タイター（vg）が低下

同じ投与量でも発現が弱い／不安定

in vivo では

• 免疫応答リスク↑
• 実効投与量の再現性低下

臨床用途では規制上の品質リスク

③ 空カプシド比率を下げるための実践的対策

ベクター設計

• ITR間サイズを 4.5–4.8 kbに最適化

• 不要配列の削除、配列の単純化

• 必要に応じて stuffer sequence の追加

包装条件の最適化

• Rep:Cap:GOI の比率を検証（例：1:1:1 または 1:1:2）

• Cap過剰にならないよう調整

• 高品質・低エンドトキシンプラスミドを使用

細胞・培養管理

• 低継代 HEK293 細胞を使用

• トランスフェクション時のコンフルエンシー：70–80%

• 一貫した培養条件を維持

精製戦略

• CsCl 超遠心（研究用途向け、分離精度高）

• 空/実カプシド分離カラムの併用

• 密度勾配＋アフィニティの二段階精製

品質評価

• qPCR（vg）＋ELISA（capsid）で Full/Empty 比を算出

• AUC、TEM などによる詳細解析（可能であれば）

④ まとめ（チェックリスト）

✔ ゲノムサイズは適正か
✔ Rep/Cap/GOI の発現バランスは取れているか
✔ 細胞状態・回収時間は最適か
✔ 精製法は目的に合っているか