AAV の部分包装・誤包装・不完全包装

1. 部分包装（Partial Packaging）

定義

部分包装とは、AAV カプシド内に目的遺伝子発現カセットの一部のみが封入され、完全長のトランスジーンがパッケージングされていない状態を指す。
主に、AAV の包装容量上限（約 4.7 kb）に近い、またはそれを超過した場合に発生しやすい。

主な原因

• トランスジーンサイズが過大（4.7 kb 超）

• ITR と内部配列による二次構造の形成

• Rep タンパク質による複製過程での早期終了

• 複雑な発現カセット構造（反復配列、複数の polyA 配列など）

特徴

• カプシド構造自体は正常

• ゲノムは 5′ または 3′ 末端が欠失していることが多い

• 単一部位のみを標的とした qPCR では、機能的力価が過大評価される可能性がある

実験への影響

• 目的遺伝子が発現しない、または発現レベルが著しく低下する

• in vivo 実験における再現性の低下

• 「力価は高いが発現しない」という結果を引き起こす

2. 誤包装（Mispackaging）

定義

誤包装とは、AAV カプシド内に目的の AAV ベクターゲノム以外の DNA 断片が封入される現象を指す。

誤って包装される主な DNA

• 宿主細胞（例：HEK293 細胞）のゲノム DNA

• Helper プラスミド由来配列

• Rep/Cap プラスミド断片

• 非目的の AAV 配列

主な原因

• 遊離 DNA の分解処理が不十分

• トランスフェクション時のプラスミド比率の不適切さ

• 細胞破砕後の核酸除去工程の不十分さ

• Rep タンパク質の発現異常

実験への影響

• 機能性 AAV ベクターの割合が低下

• in vivo 実験や前臨床研究における安全性リスクの増大

• qPCR による力価測定において、力価が過大評価される可能性

3. 不完全包装（Incomplete Packaging）

定義

不完全包装とは、AAV 内に封入されたゲノム DNA が構造的に不完全な状態を指し、以下のようなケースを含む：

• 片側 ITR の欠失

• ITR 構造の異常

• 非対称なゲノム構造や異常な snapback ゲノム

※ 部分包装が主に「ゲノム長」に起因する問題であるのに対し、不完全包装はゲノム構造の完全性の欠如を強調する概念である。

主な原因

• ITR 配列の変異または不安定性

• DNA 複製過程における損傷

• 細胞ストレスや培養条件の不安定性

• Rep 依存的な複製異常

実験への影響

• 安定した二本鎖 DNA が形成されない

• 転写が正常に開始されない

• 遺伝子発現効率の著しい低下、あるいは完全な発現不全

4. 3 種類の比較

5. 主な検出・評価方法

• 複数部位 qPCR（5′／中央／3′）

• ddPCR によるゲノム完全性評価

• Southern blot 解析

• NGS による誤包装 DNA の同定

• 機能評価（感染試験、発現解析）