ウイルスパッケージングにおける空カプシド率を低減する方法

ウイルスパッケージング（特に AAV）において、空カプシド（empty capsid）率が高いことは、最も一般的かつ実験結果に大きく影響する問題の一つです。以下では、ベクター設計、パッケージング条件、精製工程、品質評価の4つの観点から、空カプシド率を低減するための実践的な対策を解説します。

一、ベクター設計段階で空カプシドを抑制する（最重要）

1️⃣ 遺伝子サイズを適切に設計する

• AAV の最適パッケージングサイズ：4.4～4.7 kb（ITR 含む）

• 遺伝子が短すぎる（<3.8 kb）または上限に近い（>4.9 kb）場合、
  👉 空カプシドの割合が大幅に増加する

対策

• 不要な配列（冗長な polyA、WPRE など）を削除

• 小さすぎる遺伝子には中性スペーサー配列を追加

2️⃣ ITR 配列の完全性を必ず確認する

• ITR の欠失や変異 → ゲノムがパッケージングされず、空カプシドのみ生成

• 主な原因：

  • 大腸菌内での組換え

  • ORF のみを確認し、ITR を検証していない

対策

• ITR 安定菌株（Stbl3 など）を使用

• 上流工程で 制限酵素消化（SmaI、BssHII）による ITR 確認を実施

二、パッケージング条件の最適化（封入効率に直結）

3️⃣ 三種類プラスミドの比率を最適化する

一般的な AAV 三プラスミドシステム：

• トランスファープラスミド

• Rep/Cap プラスミド

• Helper プラスミド

📌 Rep の過剰発現は空カプシド増加の主要因

参考比率（目安）

• Transfer : Rep/Cap : Helper ≈ 1 : 1 : 2

• 空カプシドが多い場合、Rep/Cap をやや減量

4️⃣ 血清型の選択

• 血清型によって空カプシド生成傾向が異なる

  • AAV2、AAV6：空カプシドが多い傾向

  • AAV8、AAV9：比較的封入効率が高い

👉 組織特異性に制限がなければ、封入効率の高い血清型を優先

5️⃣ 細胞状態とトランスフェクション品質

• HEK293 細胞の状態不良 → カプシド形成のみ進行し、ゲノムが入らない

• 注意点：

  • トランスフェクション時の細胞密度：70～80%

  • マイコプラズマ陰性

  • 新鮮な PEI を使用し、比率を一定に保つ

三、精製工程で空カプシドを除去する（差が出る工程）

6️⃣ 粗精製のみの使用は避ける

• PEG 沈殿、カラム精製のみでは
  ❌ 空カプシドと実カプシドの分離は不可能

7️⃣ 密度勾配遠心を用いる

推奨方法（研究用途）

• ヨードキサノール勾配（15% / 25% / 40% / 60%）

• CsCl 勾配（より高精度だが時間がかかる）

👉 40% 層に実カプシドが濃縮
👉 上層は主に空カプシド

四、品質評価：本当に空カプシドが多いのか？

8️⃣ 複数手法による評価が必須

qPCR のみでは誤判断の可能性あり：

空カプシド率低減 =適切な遺伝子サイズ + ITR 完全性 + Rep 発現制御 + トランスフェクション最適化 + 密度勾配精製