AAV 包装・回収に関するよくある質問（FAQ）

Q1：AAV パッケージング後、ウイルスは培養上清中に直接放出されますか？

完全には放出されません。AAV はパッケージング過程において、約 70～90% が細胞内に保持され、培養上清中に放出されるウイルスは一部に限られます。そのため、上清のみを回収すると総ウイルス収量が低下する可能性があります。

Q2：AAV 回収時に凍結融解処理は必須ですか？

必須ではありませんが、研究用途では一般的に行われます。

凍結融解の有無は、ウイルス収量・純度・用途によって判断されます。

• 研究用 AAV：
  細胞と上清を同時に回収し、2～3 回の凍結融解処理を行うことで、細胞内ウイルスを放出し、総力価を向上させます。

• 高品質・規格準拠の製造：
  凍結融解は通常推奨されず、酵素法や温和な細胞破砕法が用いられます。

Q3：凍結融解処理の目的は何ですか？

主な目的は以下の通りです：

• 細胞構造の破壊

• 細胞内に存在する AAV 粒子の放出

• 総ウイルス回収量の向上

Q4：凍結融解は AAV の品質に影響しますか？

一定の影響があります。

凍結融解により収量は向上しますが、以下の点に注意が必要です：

• 宿主細胞由来タンパク質（HCP）の増加

• 宿主 DNA 残留量の増加

• 下流精製工程の負担増加

そのため、凍結融解は主に研究用途向けの手法とされています。

Q5：凍結融解は何回行うのが適切ですか？

一般的には 2～3 回（−80℃ ↔ 37℃）が推奨されます。

過度な凍結融解は、収量の改善につながらないだけでなく、不要な不純物の増加を招く可能性があります。

Q6：上清のみを回収し、凍結融解を行わないことは可能ですか？

可能ですが、以下の点を考慮する必要があります：

• 不純物は比較的少ない

• ウイルス力価は低くなる傾向

低力価でも問題ない初期評価や機能確認実験に適しています。

Q7：前臨床または GMP グレードの AAV 製造でも凍結融解は使用されますか？

通常は使用されません。

前臨床・GMP 製造では、以下の方法が一般的です：

• 核酸分解酵素（例：Benzonase）を用いた処理

• 温和な化学的細胞破砕

• 機械的破砕

これにより、ウイルス回収効率と品質管理の両立が可能となります。

Q8：凍結融解処理はすべてのウイルスベクターに適用できますか？

適用できません。

凍結融解は、主に AAV のような非エンベロープ型で細胞内に多く存在するウイルスに用いられます。

レンチウイルスなどのエンベロープウイルスでは、凍結融解により粒子が損傷する可能性があるため推奨されません。

まとめ

AAV は主に細胞内に存在するため、研究用途では凍結融解により回収量を向上させることが一般的です。

一方で、高品質や臨床関連用途では、より温和で制御可能な細胞破砕法が推奨されます。