AAV（アデノ随伴ウイルス）ノックダウン／過剰発現よくあるご質問

本 FAQ は、AAV を用いた遺伝子ノックダウン（Knockdown）および遺伝子過剰発現（Overexpression）に関して、研究者の皆様から寄せられる代表的なご質問をまとめたものです。

Q1：AAV で遺伝子ノックアウト（KO）は可能ですか？

AAV 自体にはゲノム編集能はなく、単独で遺伝子ノックアウト（KO）を行うことはできません。AAV ノックダウンは、shRNA または miRNA を介して標的遺伝子の mRNA 発現を抑制する方法です。KO を目的とする場合は、CRISPR/Cas9 システムとの併用が一般的です。

Q2：AAV ノックダウンではどの方法が一般的ですか？

主に以下の 2 種類が使用されます。

• AAV-shRNA
• AAV-miRNA（miR-shRNA）

miRNA ベースの構造は内在性 miRNA 経路に近く、in vivo 実験において毒性が低く、安定したノックダウンが可能なため、現在主流となっています。

Q3：AAV-shRNA に毒性が生じるのはなぜですか？

shRNA が過剰に発現すると、細胞内の miRNA 処理経路が飽和し、正常な遺伝子発現制御に影響を及ぼす可能性があります。miRNA ベースの設計や発現量の最適化により、毒性リスクを低減できます。

Q4：ノックダウン効果はどのくらいで確認できますか？

• in vitro：通常 3～7 日以内
• in vivo：約 2～4 週間で安定した効果が得られます

Q5：ノックダウン効率が低い原因は何ですか？

主な原因として以下が考えられます。

• 標的配列設計の最適化不足
• プロモーターの選択不適切
• AAV 血清型と標的組織の不一致
• 投与ウイルス量不足

Q6：AAV で過剰発現可能な遺伝子サイズの上限は？

AAV の最大パッケージ容量は 約 4.7 kb（ITR 含む）です。サイズが大きい遺伝子については、短縮型コンストラクトや Dual AAV（2 ベクター戦略）が用いられます。

Q7：in vivo で発現までに時間がかかるのはなぜですか？

AAV は一本鎖 DNA ウイルスであり、細胞内で二本鎖化されてから転写が開始されるため、in vivo では発現までに 2～4 週間を要するのが一般的です。

Q8：AAV は宿主ゲノムに組み込まれますか？

AAV ベクターは主にエピソーマル（非染色体性）として存在し、ゲノムへのランダムインテグレーションは極めて低頻度です。そのため、安全性の高いベクターとして広く利用されています。

Q9：過剰発現が確認できない原因は？

• プロモーターの in vivo サイレンシング
• 遺伝子サイズがパッケージ限界に近い／超過している
• 転写後調節やスプライシング異常
• 評価タイミングが早すぎる

Q10：ノックダウンと過剰発現、どちらを選ぶべきですか？

• 遺伝子機能を抑制したい場合：AAV ノックダウン
• 遺伝子機能を強化・補償したい場合：AAV 過剰発現

研究目的や実験系に応じて最適な方法をご提案します。

Q11：AAV の発現はどのくらい持続しますか？

非分裂細胞や低分裂細胞では、数か月から数年にわたり安定した発現が維持されます。

Q12：対照ベクターは必要ですか？

再現性の高い結果を得るため、以下の対照設定を推奨します。

• ネガティブコントロール（空ベクター／スクランブル）
• ポジティブコントロール