AAVによる遺伝子ノックダウンでは、事前に細胞予備実験を行う必要がありますか？

結論：原則として実施を強く推奨いたします。

AAVを用いた遺伝子ノックダウン研究では、動物実験に進む前にin vitro（細胞レベル）での予備検証を行うことで、実験成功率を大幅に向上させることが可能です。

■ なぜ細胞予備実験が必要なのか

1. ノックダウン効率の事前評価

AAVによるノックダウンは主に以下の手法に基づきます：

• shRNA

• miRNAベースshRNA

• CRISPRi（dCas9システム）

干渉配列ごとにノックダウン効率は大きく異なるため、細胞レベルで以下の評価を行うことが重要です：

• qPCRによるmRNA発現量解析

• Western blotによるタンパク質発現解析

これにより、最も高効率な干渉配列を選定できます。

2. 発現カセットの機能確認

以下の点を事前に検証する必要があります：

• U6、H1などのプロモーターが正常に機能しているか

• 予期せぬスプライシングや発現異常の有無

• 細胞への感染効率が十分かどうか

3. 動物実験リスクの低減

動物実験を直接実施した場合の主なリスク：

• ノックダウン効率不足

• 組織特異的発現の不十分

• 表現型が明確に得られない

動物実験は高コスト・長期間を要するため、事前検証は極めて重要です。

■ 必須と考えられるケース

• 新規設計shRNA配列

• 未検証の標的遺伝子

• 新規血清型AAVの使用

• 新規プロモーター構成

• 初めて使用するベクターシステム

■ 実施を省略可能なケース（限定的）

• 既報で十分に検証されたshRNA配列

• 同一研究室で実績のある構築系

ただし、その場合でも最低限の発現確認試験は推奨されます。

■ 推奨実験フロー

1. 1.2〜3種類のshRNA配列を設計

2. 2.プラスミドトランスフェクションによるノックダウン効率評価

3. 3.最適配列選定後にAAVパッケージング

4. 4.ウイルス感染による再検証

5. 5.動物実験へ移行

■ まとめ

AAVを用いた遺伝子ノックダウン研究においては、動物実験前にin vitroでの予備検証を行うことにより、実験成功率の向上および研究コストの最適化が期待できます。