AAV動物実験における発現不良トラブル対策 FAQ

Q1：AAV投与後に目的遺伝子の発現が確認できません。ウイルスは失活していますか？

必ずしもウイルスの失活を意味するものではありません。

主な原因として、以下が考えられます。

• 投与部位の定位誤差

• 投与量不足

• 解析時期が早すぎる

• プロモーターと標的組織の不適合

• 空カプシド率が高い

• トランスジーン自体の発現不良

推奨される確認手順：

1. 1.投与部位の組織学的確認

2. 2.ベクターゲノムコピー数（qPCR）測定

3. 3.mRNA発現解析（RT-qPCR）

4. 4.タンパク質発現解析（WB／IF）

Q2：蛍光シグナルが弱い場合の改善策は？

以下の点をご検討ください。

① 投与量の最適化

• 脳内定位注入：1E12 vg/mL以上推奨

• 静脈投与：1E13 vg/mL以上推奨

② プロモーターの再検討

• 強力汎用型：CAG、EF1α

• 神経特異的：hSyn

• 肝特異的：TBG

※ 組織特異的プロモーターは一般に発現強度が低い傾向があります。

③ 解析時期の延長

• CNS実験：3～4週間後推奨

• 肝臓実験：2週間後以降

④ 抗体によるシグナル増強

• anti-GFP抗体等による免疫染色の併用

Q3：血清型の選択は発現に影響しますか？

大きく影響します。

代表例：

• AAV2：神経系で広く使用

• AAV9：血液脳関門通過能あり

• PHP.eB：C57BL/6マウスCNSで高効率

• AAV8：肝臓高発現

※ マウス系統や動物種によって発現効率が大きく異なります。

文献調査および小規模予備試験を推奨します。

Q4：ベクターサイズは発現効率に影響しますか？

はい。

AAVの最大パッケージング容量は約4.7 kb（ITR含む）です。

超過した場合：

• 低力価

• 不完全パッケージング

• 発現不安定

対策：

• 不要配列の削減

• mini promoter使用

• デュアルAAV戦略の検討

Q5：空カプシドは発現効率に影響しますか？

はい。

空カプシドは受容体を占有し、有効感染効率を低下させます。

対策：

• 高純度精製法（密度勾配＋クロマトグラフィー）

• Full/Empty比率データの確認

Q6：細胞レベルの事前検証は必要ですか？

強く推奨します。

細胞実験により：

• 遺伝子発現可否

• 細胞毒性

• プロモーター活性

を事前確認でき、動物実験リスクを低減できます。

Q7：発現安定までの一般的な期間は？

一般的に：

• 1週目：発現開始

• 2～3週目：発現増強

• 3～4週目：安定期

早期解析は偽陰性の原因となる可能性があります。