AAV超遠心分離後における各分画層の成分解析

AAV（アデノ随伴ウイルス）を超遠心分離した後、「各層に何が存在するか」は、使用している分離法によって異なります。最も一般的なのは ヨードキサノール密度勾配超遠心法（iodixanol gradient ultracentrifugation） と CsCl（塩化セシウム）密度勾配遠心法 です。現在、AAV精製では前者が主流のため、まずヨードキサノール法を基準に説明します。

1. ヨードキサノール密度勾配超遠心法（最も一般的）

通常、下記のような多層勾配を作成します（上層から下層へ）。

15%層（最上層）

• サンプル上清または粗抽出液
• 細胞由来タンパク質、破片、軽い夾雑物が多い

25%層

• 一部の夾雑タンパク質
• 空カプシド（empty capsid）の一部
• 比較的低密度のAAV粒子

40%層（最重要画分）

• ゲノムを内包した完全粒子（full capsid）の大部分が存在
• 多くの場合、40%層下部〜60%層との界面付近 に集中

60%層（最下層）

• 高密度夾雑物
• 凝集体や沈降性粒子
• 一部ウイルス粒子が界面付近に存在する場合あり

2. 実際の回収位置（一般的操作）

AAV回収時は通常、

シリンジ針で遠心チューブ側面から穿刺し、40%–60%界面付近を2〜4 mL回収 します。

この画分は、一般に 力価が高く、純度も良好 です。

3. Empty capsid と Full capsid の分布

• Empty capsid（空粒子）：密度が低く、25%–40%付近
• Full capsid（実粒子）：密度が高く、40%–60%界面付近
• 凝集体・破片：上層または最下層に分布

4. CsCl 密度勾配遠心の場合

CsCl法では、empty/full capsid の分離能がより高いです。

• 上側バンド：Empty capsid
• 下側バンド：Full capsid（DNA封入粒子）

ただし、毒性・処理時間・透析工程の負担から、近年はヨードキサノール法が広く使用されています。