レンチウイルス（Lentivirus）の作製後、培養上清中には目的のレンチウイルス粒子だけでなく、培養細胞由来のさまざまな不純物も含まれています。超遠心法、PEG沈殿法などによって得られる「レンチウイルス沈殿物」は、純粋なウイルスではなく、多様な成分から構成される混合物です。
レンチウイルス遠心沈殿物の主な構成成分
1. レンチウイルス粒子（主要成分）
最も重要な成分は感染能を有する完全なレンチウイルス粒子です。主な構造は以下のとおりです。
- 脂質二重膜エンベロープ（Lipid Envelope）
- エンベロープタンパク質（例：VSV-G）
- HIV-1 Gagタンパク質から形成されるカプシド
- ウイルスRNAゲノム
- 逆転写酵素（Reverse Transcriptase）
- インテグラーゼ（Integrase）
- プロテアーゼ（Protease）
これらの完全粒子が最終的な感染価（TU/mL）を決定します。
2. 不完全なウイルス粒子
パッケージング工程では、すべてのウイルス粒子が正常に組み立てられるわけではありません。そのため、沈殿物には以下のような感染性を持たない粒子も含まれます。
- RNAを含まない空粒子（Empty Particles）
- 未成熟ウイルス粒子
- 一部の構造タンパク質が欠損した粒子
- 感染能を持たない粒子
これらは物理粒子数を増加させますが、機能的な感染価には寄与しません。
3. 細胞由来エクソソーム（Exosomes）
HEK293Tなどのパッケージング細胞は、培養中にエクソソームを継続的に分泌します。エクソソームの粒径（約30～150 nm）はレンチウイルス（約80～120 nm）と近いため、
- レンチウイルスとともに沈殿しやすい
- 一般的な遠心操作では完全に分離することが難しい
- レンチウイルス製剤中の代表的な不純物となる
という特徴があります。
4. マイクロベシクル（Microvesicles）
エクソソームに加えて、パッケージング細胞は以下のような細胞由来小胞も放出します。
- マイクロベシクル（100～1000 nm）
- 細胞膜断片
これらも高速遠心によってレンチウイルスと共沈することがあります。
5. 宿主細胞由来タンパク質（Host Cell Proteins, HCP）
沈殿物には以下のような宿主細胞由来タンパク質も含まれる場合があります。
- アルブミン様タンパク質
- 細胞骨格タンパク質
- ヒートショックタンパク質（HSP）
- 核タンパク質
- 膜タンパク質
これらのタンパク質はウイルス表面に吸着したり、凝集体を形成したりするため、ウイルスとともに沈殿しやすくなります。
6. 宿主由来核酸
沈殿物には以下の核酸が残存していることがあります。
- 宿主DNA
- 宿主RNA
- パッケージングプラスミド由来DNA
- 遊離RNA
Benzonaseなどのヌクレアーゼ処理を行うことで、これらの核酸不純物を大幅に低減できます。
7. 血清由来タンパク質（血清含有培地を使用した場合）
ウイルス回収時に培地へFBSが含まれている場合、以下のような血清由来成分も共沈する可能性があります。
- ウシ血清アルブミン（BSA）
- 各種血清タンパク質
- リポタンパク質
そのため、多くの研究室では、ウイルス回収時に低血清培地または無血清培地を使用し、タンパク質由来不純物を低減しています。
8. 凝集体（Aggregates）
ウイルス濃縮中には以下のような凝集体が形成されることがあります。
- ウイルス粒子の凝集体
- タンパク質凝集体
- 脂質凝集体
凝集は感染効率の低下や、ウイルス力価測定の精度に影響を及ぼす可能性があります。
濃縮方法による沈殿物の純度の違い
沈殿物中の不純物を減らす方法
高純度のレンチウイルスを得るためには、以下の方法が有効です。
1.ウイルス回収前に低血清または無血清培地へ切り替える。
2.回収した培養上清を低速遠心後、0.45 μmフィルターでろ過し、細胞や大きな細胞片を除去する。
3.Benzonaseなどのヌクレアーゼで遊離DNAおよびRNAを分解する。
4.スクロースクッション超遠心法、密度勾配遠心法、またはクロマトグラフィー精製を用いて、エクソソームや宿主タンパク質などの不純物を除去する。
5.濃縮後にPBSなどの適切なバッファーへバッファー交換を行い、PEGやスクロースなどの残留物を除去する。
まとめ
レンチウイルスの遠心沈殿物は、完全なレンチウイルス粒子だけで構成されているわけではありません。実際には、完全粒子、不完全粒子、エクソソーム、マイクロベシクル、宿主細胞由来タンパク質、宿主由来核酸、血清タンパク質、さらに各種凝集体などが含まれています。
使用する濃縮・精製方法によって不純物の量は大きく異なり、それが最終製剤の純度、感染活性、および実験の再現性にも影響します。そのため、特にin vivo実験や高純度が求められる研究では、濃縮後にさらに精製工程を組み合わせることで、品質の安定したレンチウイルス製剤を得ることが推奨されます。
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