AAVの品質検査では何を確認する？ウイルス力価・空カプシド・純度・活性を解説

AAVの製造が終わった後、検査結果を確認するときに、まず目にすることが多いのがウイルス力価（Titer）です。

例えば、AAVの力価が1×10¹³ vg/mLだった場合、数値としては高いように見えます。しかし、この数値だけでAAVの品質全体を判断することはできません。

AAVの品質は、単一の指標だけで決まるものではないためです。

ウイルス力価だけでなく、ウイルスの同一性（Identity）、Full/Empty比、ゲノム完全性、純度、エンドトキシン、マイコプラズマ、生物学的活性などを総合的に確認する必要があります。

また、研究用途や開発段階によって、重要となる品質項目も異なります。

では、AAVの品質検査では具体的にどのような項目を確認するのでしょうか。

AAVのウイルス力価：重要な指標だが、これだけでは不十分

AAVの品質検査で最も一般的に確認される項目の一つがウイルス力価です。

AAVのベクターゲノム量は、qPCRやddPCRを用いて測定することが多く、一般的にvg/mL（vector genomes per mL）またはGC/mL（genome copies per mL）で表されます。

この値は、試料中に存在するAAVベクターゲノムの量を示すものです。

ただし、ここで注意したい点があります。

vg/mLが高いからといって、すべてのAAV粒子が正常な生物学的活性を持っているとは限りません。

例えば、ベクターゲノム力価が高くても、Empty Capsidが多く含まれていたり、一部しかゲノムを含まない粒子が存在したりする場合があります。

そのため、実際の細胞への導入効率がウイルス力価と必ずしも一致するとは限りません。

ウイルス力価はAAVの品質評価において重要な指標ですが、これだけで製品全体の品質を判断することはできません。

Empty Capsidの割合も重要

AAVの製造工程では、すべてのカプシドが完全なベクターゲノムを正常にパッケージングするわけではありません。

最終的なAAV試料には、Full Capsid、Empty Capsid、Partial Capsidなどが含まれる場合があります。

Full Capsidはベクターゲノムを含むウイルス粒子、Empty Capsidはベクターゲノムを含まない空のカプシドを指します。

そのため、AAVの品質検査では、以下のような項目が重要になります。

• Full Capsid
• Empty Capsid
• Full/Empty Ratio
• Partial Capsid

Empty Capsidが存在すること自体が、AAV製造の失敗を意味するわけではありません。

一方で、Empty Capsidの割合は最終製品の粒子組成を評価するうえで重要な指標の一つであり、AAVの製造・精製工程を評価する際にも確認されます。

AAVに含まれるベクターゲノムは完全なのか？

AAVのゲノム力価が高いからといって、すべての粒子が完全なベクターゲノムを持っているとは限りません。

特に、搭載する発現カセットがAAVの限られたパッケージング容量に近い場合には、ゲノム完全性をより慎重に確認する必要があります。

一部の粒子でベクターゲノムが部分的にしかパッケージングされていない、あるいは短縮されたゲノムが存在する可能性があるためです。

必要に応じて、以下のような項目を確認します。

• Genome Integrity
• Full-length Genome
• Partial Genome
• GOIの完全性
• ITRなど重要配列の完全性

一般的な小型ベクターではこの問題が比較的目立たない場合もありますが、大きな遺伝子を搭載するAAV、複雑な発現カセット、パッケージング容量に近いベクターでは、ゲノム完全性を特に注意して確認することが重要です。

AAVの純度はどのように確認する？

ウイルス力価が高いことと、AAV試料の純度が高いことは同じ意味ではありません。

AAVの製造では宿主細胞やプラスミドなどを使用するため、最終試料には製造工程に由来する不純物が残留する可能性があります。

代表的な検査項目として、以下が挙げられます。

宿主細胞由来タンパク質（HCP）

Host Cell Protein（HCP）は、AAVを生産する宿主細胞に由来するタンパク質です。

HCPの測定は、下流の精製工程で宿主細胞由来タンパク質がどの程度除去されているかを評価するために利用されます。

宿主細胞由来DNA（Host Cell DNA）

AAVの製造工程では、宿主細胞由来DNAが残留する可能性があります。

そのため、製品の用途や品質管理基準に応じてHost Cell DNAを測定します。

残留プラスミドDNA

プラスミドを用いた一過性トランスフェクションによってAAVを製造する場合、製造工程で使用したプラスミドDNAの残留量を確認することがあります。

このほか、製造方法や製品の用途に応じて、その他の工程由来残留物についても評価する場合があります。

動物実験に使用するAAVでは、エンドトキシンやマイコプラズマも重要

AAVをin vitroの細胞実験だけに使用する場合と、動物へのin vivo投与に使用する場合では、品質管理で重視する項目が異なります。

特に動物実験で体内投与を行う場合には、試料の安全性に関わる項目を確認することが重要です。

代表的な検査項目には以下があります。

• Endotoxin（エンドトキシン）
• Mycoplasma（マイコプラズマ）
• Sterility（無菌試験）
• Bioburden（バイオバーデン）

特にin vivo投与用AAVでは、エンドトキシンは重要な管理項目の一つです。

ただし、必要な検査項目や許容基準は、動物種、投与経路、研究目的、製品グレードなどによって異なります。

AAVが凝集していないか？

AAVは製造が完了した後も、保存や取り扱いの条件によって状態が変化する可能性があります。

濃縮、精製、保存、あるいは繰り返しの凍結融解によって、AAV粒子が凝集することがあります。

そのため、製品の特性や用途によっては、以下のような粒子特性を確認する場合があります。

• Aggregation
• Particle Size
• PDI
• Particle Distribution

AAVの凝集が増加すると、試料の安定性や粒子の均一性などに影響する可能性があります。

そのため、AAVを長期間保存する場合や複数回使用する場合には、保存条件や凍結融解回数についても適切に管理することが重要です。

最後に確認したいのは、AAVが実際に機能するかどうか

AAVの品質を評価する際には、ウイルス力価と生物学的活性を同じものとして考えないことが重要です。

AAVの力価が高いからといって、必ずしも高い遺伝子導入効率や期待される生物学的機能が得られるとは限りません。

そのため、ベクターの目的に応じて、実際の機能を評価する試験を行うことがあります。

例えば、以下のような方法があります。

• 細胞への遺伝子導入試験
• GFP、mCherryなどのレポーター遺伝子発現解析
• Luciferase発現解析
• GOI発現解析
• 機能性タンパク質の測定
• Potency Assay

どの方法を使用するかは、AAVベクターの設計や最終的な使用目的に応じて決定する必要があります。

AAVの品質検査では、何を確認すればいい？

ここまで見てきたように、AAVの品質検査は、いくつかのシンプルな質問に整理することができます。

目的のAAVで間違いないか？

→ Identity

どれくらいのAAVが存在するか？

→ vg/mL、GC/mLなどのTiter

AAV粒子にベクターゲノムが正しく入っているか？

→ Full/Emptyおよび粒子分析

パッケージングされたゲノムは完全か？

→ Genome Integrity

試料はどの程度純粋か？

→ HCP、Host Cell DNA、残留プラスミドDNAなど

動物実験やin vivo投与に適しているか？

→ Endotoxin、Mycoplasma、Sterilityなど

AAVは実際に期待した機能を持っているか？

→ Transductionおよび機能性評価

このように、AAVの品質は単純に「ウイルス力価が高いかどうか」だけで判断することはできません。

Titer、Full/Empty、Genome Integrity、Purity、Safety、Biological Activityなど、複数の指標を組み合わせて評価することが重要です。

また、すべてのAAV製品に同じ検査項目が必要というわけではありません。研究用AAV、動物実験用AAV、前臨床研究用AAV、GMP製造用AAVでは、求められる品質管理の内容やレベルが異なります。

AAVの品質検査を計画する際には、ベクターの種類、研究目的、投与方法、開発段階を踏まえて、必要な分析項目を設定することが重要です。